Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Фталальдегидный реактив. К 5 мл фталальдегидного основного раствора добавляют 15 мкл 2-меркаптоэтанола Р. Раствор готовят не менее, чем за 30 мин до начала использования. Хранят в течение 24 ч.
Методика. Смешивают 10 мкл исследуемого раствора и каждого из стандартных растворов с 0,1 мл фталальдегидного реактива и выдерживают при комнатной температуре 15 мин. Прибавляют 3 мл 0,5 М раствора натрия гидроксида Р и смешивают. Определяют флюоресценцию (2.2.21.) стандартных растворов и исследуемого раствора при активированной длине волны 340 нм и эмиссионной длине волны от 440 до 455 нм. Измеряют флюоресценцию данных растворов единожды, поскольку излучение снижает интенсивность флюоресценции.
Расчеты. Зависимость флюоресценции от концентрации белка имеет линейный характер. Строят график зависимости флюоресцентной интенсивности стандартных растворов от концентрации белка и используют линейную регрессию для формирования стандартного графика. На основании графика и флюоресцентной интенсивности стандартного раствора определяют концентрацию белка в исследуемом растворе.
МЕТОД 7
Данный метод основывается на определении содержания азота, как способе определения белка. Интерференция, вызванная присутствием других азотсодержащих веществ в исследуемом образце, может влиять на определение белка при помощи данного метода. Техника азотного анализа основана на разрушении исследуемого образца.
Методика А. Выполняется в соответствии с описанной в частной статье процедурой для определения азота минерализацией серной кислотой (2.5.9) или при помощи прибора для определения азота по Кьельдалю.
Методика В. Анализ может выполняться при помощи приборов. Большинство приборов, применяемых для азотного анализа, используют пиролиз (сжигание образца в токе кислорода при температуре близкой к 1000оС). При этом выделяется оксид азота (NO) и другие оксиды азота (NOx) из азота, присутствующего в исследуемых веществах. В некоторых приборах окись азота преобразуется в азот, который измеряется теплопроводным детектором. В других приборах оксид азота (NO) смешивается с озоном (O3), образуя при этом активированный диоксид азота (NO2*), который испускает свет при распаде и может быть измерен хемилюминесцентным детектором. Стандартный образец белка, который относительно чист и схож по своему составу с исследуемыми белками, используется для оптимизации параметров пиролиза и оценки последовательности анализа.
Расчеты. Содержание белка рассчитывается делением содержания азота в исследуемом образце на известное содержание азота в белке. Известное содержание азота в белке можно определить на основе химического состава белка или сравнения с подходящим стандартным образцом.
2.5.34. УКСУСНАЯ КИСЛОТА В СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДАХ
Исследование проводят методом жидкостной хроматографии (2.2.29). Исследуемый раствор. Готовят исследуемый раствор, как указано в частной статье.
Стандартный раствор. Готовят раствор 0,10 г/л кислоты уксусной ледяной Р в смеси с 5 объемами мобильной фазы B и 95 объемами мобильной фазы A. Хроматографическая процедура может проводиться с использованием:
— колонок из нержавеющей стали длиной 0,25 м и 4,6 мм внутреннего диаметра с неподвижной фызой октадецилсилил силикагелем для хроматографии Р (5 мкм);
— скорость потока мобильной фазы 1,2 мл/мин;
— мобильная фаза A: разводят 0,7 мл кислоты фосфорной Р до 1000 мл водой Р, корректируют pH до 3,0 концентрированным раствором натрия гидроксида Р;
— мобильная фаза B: метанол R2
Время (мин) Мобильная фаза A Мобильная фаза B
(% об/об) (% об/об)
0 - 5 95 5
5 - 10 95 ^ 50 5 ^ 50
10 - 20 50 50
20 - 22 50 ^ 95 50 ^ 5
22 - 30 95 5
— спектрофотометрический детектор с длиной волны 210 нм.
Вводят 10 мкл стандартного раствора и 10 мкл исследуемого раствора. В полученных хроматограммах пик, соответствующий уксусной кислоте, имеет время удерживания 3-4 мин. Основная линия представляет собой крутой пик в начале линейного градиента, который соответствует элюированию пептидов из колонки. Определяют содержание уксусной кислоты в пептиде.
# 2.5.35. ТИТРОВАНИЕ В НЕВОДНЫХ РАСТВОРИТЕЛЯХ
Метод кислотно-основного титрования в неводных растворителях применяется для количественного определения веществ, представляющих собой кислоты, основания или соли, титрование которых в воде затруднено или невозможно из-за слабых кислотно-основных свойств или малой растворимости.
В неводных растворителях резко изменяются кислотно-основные свойства различных веществ. В зависимости от растворителя одно и то же вещество может быть кислотой, основанием или вообще не проявлять кислотно-основных свойств. Применение различных растворителей позволяет управлять кислотно-основными свойствами веществ.
Выбор растворителя осуществляется на основании величин констант титрования Кт или их отрицательных логарифмов рКТ. Величина рКт является критерием возможности и точности титрования. Чем больше эта величина, тем лучше условия титрования. Константа титрования определяется двумя основными величинами: константой кислотности титруемой кислоты (Ка), или константой кислотности кислоты, сопряженной с титруемым основанием (КВН+), и константой автопротолиза растворителя (Кен).
